高难度实验频频失败?科研小助手——全式金实验技术服务平台 为您助力

2020-04-21

遗传使生命世代繁衍,生生不息。而承担着生物遗传使命的重要物质——DNA,对于生命科学相关专业的我们来说并不陌生,它将遗传信息在生物个体之间进行传递。

遗传信息的传递遵循一定的规律和法则,遗传信息从DNA到DNA的复制、继而从DNA传递给RNA的转录、再从RNA传递给蛋白质的翻译过程的转移法则,是生物大分子DNA、RNA和蛋白质参与细胞生命活动所遵循的法则,这个法则就是熟知的中心法则。

中心法则

在以上遗传信息的传递过程中,每一步都有精确的调节和控制,这些调节和控制作用包括控制基因表达的开始、进行和终止,也包括调节基因表达的强弱及表达产物(即蛋白质合成)的多少等。几乎所有的生物遗传信息的传递都遵循中心法则,这为我们在实验条件下研究生命现象和生命活动等提供了重要参考。

以实验室中常进行的细胞生物学研究为例,简单了解一下常规实验流程:

图2 细胞生物学实验流程示意图

细胞培养:保持良好的细胞状态,是整个细胞学实验的基础。细胞状态良好与否有很多的影响因素,如我们的培养条件是否合适(培养液,培养温度,气体浓度等),细胞是否老化,有无其它微生物的污染等。

细胞处理:根据实验目的不同,可能会对细胞进行相应的处理。如最常见的基因过表达、干扰、敲除等;或者直接使用药物、生物活性物质等对细胞进行孵育,观察细胞的变化。

变化检测:对细胞进行实验处理后,细胞状态在宏观上可能会有明显的变化,如细胞皱缩、死亡等;也可能细胞状态无肉眼可见的变化,这时候就要进行微观分子层面的一些检测,以确定实验处理是否对细胞产生了影响。

这就涉及到不同的检测层面,一般根据中心法则中遗传信息的传递规律,分别在不同的水平上对细胞进行检测,比如DNA/RNA的复制,转录,翻译等。

根据中心法则遗传信息的传递过程,我们通常从以下几个方面进行检测:

转录水平检测:常用方法有荧光素酶报告实验,此外还有Chip-seq,EGFP标记等方法。

核酸水平检测:常用到的实验方法有qRT-PCR,高通量测序,基因芯片检测等。

蛋白表达水平检测:常用到的实验方法有Western Blot,Elisa,蛋白芯片检测等。

蛋白定位检测:常用到的实验方法有免疫荧光,免疫电镜,细胞器分离等。

蛋白相互作用:常用的有IP,Co-IP,GST-Pull Down,免疫荧光共定位,酵母双杂交;此外还有FRET等方法。

细胞状态检测:主要涉及到的方法有CCK/MTT活性检测,EdU增殖检测,Annexin V/TUNEL/JC-1凋亡检测等。

当然,细胞水平检测只是在体外验证,如果想要更深入的研究,还需要进行一些体内实验(如动物实验)。

除了实验方法,在进行研究时,还需要对实验本身进行一些设计,使得实验结果更可靠、更具有说服力。实验设计根据不同的实验会有所不同,这对于我们的研究非常重要。这些我们会在以后的内容中陆续为大家介绍。

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荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验(luciferase reporter assay)主要应用于转录水平检测。例如,检测启动子或增强子的转录活性,这意味着一个遗传信息能否进行传递。相对于EGFP,LacZ等传统转录活性测定方法,荧光素酶报告实验更为方便、快捷、准确,故该方法已经成为转录水平检测最常用的方法。

实时荧光定量

实时荧光定量(qPCR)主要用于检测基因或感兴趣转录产物(如LncRNA,mRNA,microRNA等)的表达水平。与普通的PCR方法只能检测PCR产物相比,qPCR可以每个扩增循环都检测产物生成的量,从而可以通过一系列的数学计算,得到精确的初始模板的量。这种方法目前已经是检测基因在核酸水平表达情况的常用方法。

Western Blot

Western Blot主要是检测各种基因在蛋白水平的表达情况,也可以检测不同修饰(如磷酸化)的相同蛋白表达情况。Western Blot可以对目的蛋白表达进行定性或半定量,是实验检测蛋白表达最常用的方法。由于存在各种转录后调控和翻译调控,有些情况下,核酸水平与蛋白表达水平并不一致,所以细胞学研究时,经常同时检测核酸水平和蛋白表达水平的情况。

免疫荧光检测

免疫荧光主要用于蛋白定位和多蛋白共定位的检测,同时也可检测蛋白的表达。由于结果比较直观,免疫荧光常作为蛋白定位和蛋白相互作用检测的方法。蛋白要发挥相应的功能,就需要在特定的细胞部位,或者在其细胞定位变化后其功能也随之发生变化。比如,感兴趣的蛋白定位于线粒体,它就有可能与能量代谢相关。同时,每个蛋白并不是独立行使其功能的,想要发挥其最终的功能就需要与其它蛋白相互作用,从而达到信号传递的效果;同时,找到与目的蛋白相互作用的蛋白,也可以在一定程度上揭示目的蛋白的功能。

细胞凋亡检测

细胞凋亡是细胞生命活动中一种正常的生理现象,是多基因严格控制的过程。检测细胞凋亡的方法有很多,常用的方法有TUNEL(左图),Annexin V(右图),JC-1,凋亡相关蛋白检测(如Caspase系列蛋白,细胞色素C)等。

慢病毒包装

慢病毒侵染是细胞生物学中常用的外源基因导入方法。尤其对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且可以进行稳转细胞株的筛选,也可以制备活体动物模型。

间充质干细胞三向分化

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)是一种专能干细胞,它具有干细胞的所有共性,即自我更新和多向分化能力。MSC具有特征性的三向分化潜能,即可向脂肪细胞(A)、骨细胞(B)以及软骨细胞(C)分化,这个是MSC的一个标志性特征,经常用于MSC细胞多能性的鉴定。

细胞核型分析

核型分析是细胞遗传学研究的基本方法,它是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可或缺的重要手段,是细胞遗传稳定性鉴定、研究基因定位、以及产前诊断等方面常用的研究方法。

甲基化检测

DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。Bisulfite(重亚硫酸盐)处理的方法为研究DNA甲基化的经典方法。

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